pcr反应程序如何选择

1．常规程序将PCR反应所需的成分配置完后，在PCR仪上于94-96℃预加热几十秒至几分钟，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于94℃保持30秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度（一般50-60℃之间），一般保持30秒钟，使引物与模板充分退火在72℃保持1分钟（扩增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环。重复这样的循环25～35次，使扩增的DNA片段大量累积。最后，在72℃保持3-7min，使产物延伸完整，4℃保存。

2．复性（退火）和延伸温度复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR。

3．反应时间变性步骤一般使用30秒钟，如果模板的G+C含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有30秒种一般是足够的

程序： 94℃预变性 5~10min 94℃变性30s~2min 退火 30s~2min 72℃延伸1~5min 72℃延伸5~10min 中间三步循环，具体时间依自己的模板和引物情况而定。