菌落原位杂交法的步骤

①将硝酸纤维素滤膜置于含抗生素的平皿琼脂培养基上，用无菌牙签挑取单菌落种于滤膜和主琼脂平板上，排列成方格栅，膜和板上菌落位置相同。

②培养细菌至产生1-2mm大小的菌落。

③在一块平皿中置4张滤纸，用10%SDS浸透，倒掉多余液体，将带有菌落的滤膜取下轻轻置于滤纸上，菌落面在上，注意防止滤膜底面存有气泡。

④5min后，将滤膜转至用变性溶液（0.5mol/L NaOH，1.5mol/LNaCl）浸湿的滤纸上，放置10min。

⑤将滤膜转至中和溶液（1.5mol/L NaCl， 0.5mol/L Tris-HCl

pH8.0)浸湿的滤纸上，放置10min，重复中和一次。

⑥将滤膜移至用2×SSPE溶液浸过的滤纸上，放置10min，SSPE配成20×贮备液：3.6mol/L NaCl，0.2mol/L

NaH2PO4(pH7.4)，20mmol/L EDTANa2（pH7.4)。

⑦将滤膜用滤纸吸干，80℃真空烘干2h。